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Kit de detecção Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR para 2019-nCoV
Uso esperado
Este kit é usado para a detecção qualitativa de novo coronavírus (2019-nCoV) usando zaragatoas de garganta, zaragatoas nasofaríngeas, fluido de lavagem broncoalveolar, escarro. O resultado da detecção deste produto é apenas para referência clínica e não deve ser usado como o único evidência para diagnóstico clínico e tratamento. Uma análise abrangente da condição é recomendada em combinação com as manifestações clínicas do paciente e outros exames laboratoriais.
Princípio de inspeção
O kit é baseado na tecnologia RT-PCR de uma etapa.De fato, os genes ORF1ab e N do novo coronavírus de 2019 (2019-nCoV) foram selecionados como regiões-alvo de amplificação.Primers específicos e sondas fluorescentes (as sondas do gene N são marcadas com FAM e as sondas ORF1ab são marcadas com HEX) são projetadas para detectar o novo tipo de RNA do coronavírus 2019 em amostras.O kit também inclui um sistema de detecção de controle interno endógeno (sonda de gene de controle interno marcada com CY5) para monitorar o processo de coleta de amostras, amplificação de RNA e PCR, reduzindo assim os resultados falsos negativos.
Componentes principais
| Componentes | Volume（48 T/Kit） |
| Solução de reação de RT-PCR | 96µl |
| mistura de sonda TaqMan primer nCOV (ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene) | 864µl |
| Controle negativo | 1500µl |
| nCOV Controle Positivo（l ORF1ab N Gene） | 1500µl |
Reagentes próprios: Reagentes de extração ou purificação de RNA.Controlo negativo/positivo: O controlo positivo é o ARN que contém o fragmento alvo, enquanto o controlo negativo é água isenta de ácido nucleico.Durante o uso, eles devem participar da extração e devem ser considerados infecciosos.Eles devem ser manuseados e descartados de acordo com os regulamentos relevantes.
O gene de referência interna é o gene RnaseP humano.
Condições de armazenamento e data de validade
-20 ± 5 ℃, evite congelamento e descongelamento repetidos mais de 5 vezes, válido por 6 meses.
Instrumento aplicável
Com FAM / HEX / CY5 e outro instrumento de PCR fluorescente multicanal.
Requisitos de amostra
1. Tipos de amostras aplicáveis: zaragatoas de garganta, zaragatoas nasofaríngeas, líquido de lavagem broncoalveolar, expectoração。
2. Coleta de amostras (técnica asséptica)
Swab faríngeo: Limpe as amígdalas e a parede posterior da faringe com dois swabs ao mesmo tempo e, em seguida, mergulhe a cabeça do swab em um tubo de ensaio contendo a solução de amostragem
Escarro: Após o paciente apresentar tosse profunda, coletar o escarro tossido em um tubo de ensaio com tampa de rosca contendo a solução de amostragem;fluido de lavagem broncoalveolar: Amostragem por profissionais médicos.3. Armazenamento e transporte de amostras
As amostras para isolamento de vírus e teste de RNA devem ser testadas o mais rápido possível.As amostras que podem ser detectadas em 24 horas podem ser armazenadas a 4℃;aqueles que não podem ser detectados dentro de 24
horas devem ser armazenadas a -70 ℃ ou abaixo (se não houver condição de armazenamento de -70 ℃, elas devem ser
armazenado temporariamente em -20℃geladeira).As amostras devem evitar congelamentos e descongelamentos repetidos durante o transporte.As amostras devem ser enviadas ao laboratório o mais rápido possível após a coleta.Se as amostras precisarem ser transportadas por longas distâncias, recomenda-se o armazenamento em gelo seco.
Métodos de teste
1 Processamento de amostras e extração de RNA (área de processamento de amostras)
Recomenda-se levar 200μl de amostra líquida para extração de RNA.Para as etapas de extração relacionadas, consulte as instruções dos kits comerciais de extração de RNA.Tanto o negativo quanto o negativo
controles neste kit estavam envolvidos na extração.
2 Preparação de reagentes de PCR (área de preparação de reagentes)
2.1 Remova todos os componentes do kit e descongele e misture em temperatura ambiente.Centrifugue a 8.000 rpm por alguns segundos antes de usar;calcule a quantidade necessária de reagentes e o sistema de reação é preparado conforme mostrado na tabela a seguir:
| Componentes | Porção N (sistema de 25µl) |
| nCOV primer TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| Solução de reação de RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = número de amostras testadas + 1 (controle negativo) + 1 (nCOVcontrole positivo) | |
2.2 Depois de misturar completamente os componentes, centrifugar por um curto período de tempo para deixar todo o líquido na parede do tubo cair no fundo do tubo e, em seguida, alíquotar o sistema de amplificação de 20 µl no tubo de PCR.
3 Amostragem (área de preparação da amostra)
Adicione 5μl dos controles negativo e positivo após a extração.O RNA da amostra a ser testada é adicionado ao tubo de reação de PCR.
Tampe bem o tubo e centrifugue a 8.000 rpm por alguns segundos antes de transferi-lo para a área de detecção de amplificação.
4 Amplificação por PCR (área de detecção amplificada)
4.1 Coloque o tubo de reação na célula de amostra do instrumento e defina os parâmetros da seguinte forma:
| estágio | Ciclo número | Temperatura(°C) | Tempo | coleçãosite |
| Revertertranscrição | 1 | 42 | 10min | - |
| Pré-desnaturaçãon | 1 | 95 | 1 minuto | - |
| Ciclo | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | coleção de dados |
Seleção do canal de detecção do instrumento: Selecione o canal FAM、HEX、CY5 para o sinal de fluorescência.Para referência fluorescente NENHUM, por favor, não escolha ROX.
5 Análise de resultados (Consulte as instruções experimentais de cada instrumento para configuração)
Após a reação, salve os resultados.Após a análise, ajuste o valor inicial, o valor final e o valor limite da linha de base de acordo com a imagem (o usuário pode ajustar de acordo com a situação real, o valor inicial pode ser definido como 3~15, o valor final pode ser definido como 5~20, ajuste) no gráfico logarítmico No limite da janela, a linha do limite está na fase logarítmica e a curva de amplificação do controle negativo é uma linha reta ou abaixo da linha do limite).
6 Controle de qualidade (um controle de procedimento está incluído no teste) Controle negativo: Nenhuma curva de amplificação óbvia para canais de detecção FAM, HEX, CY5
Controle positivo COV: curva de amplificação óbvia dos canais de detecção FAM e HEX, valor Ct≤32, mas sem curva de amplificação do canal CY5;
Os requisitos acima devem ser atendidos simultaneamente no mesmo experimento;caso contrário, o experimento é inválido e precisa ser repetido.
7 Determinação de resultados.
7.1 Se não houver curva de amplificação ou valor Ct> 40 nos canais FAM e HEX da amostra de teste e houver curva de amplificação no canal CY5, pode-se julgar que não há novo coronavírus 2019 (2019-nCoV) RNA na amostra;
.2 Se a amostra de teste tiver curvas de amplificação óbvias nos canais FAM e HEX e o valor Ct for ≤40, pode-se considerar que a amostra é positiva para o novo coronavírus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Se a amostra de teste tiver uma curva de amplificação clara apenas em um canal de FAM ou HEX, e o valor Ct for ≤40, e não houver curva de amplificação no outro canal, os resultados precisam ser testados novamente.Se os resultados do reteste forem consistentes, a amostra pode ser considerada positiva para o novo
coronavírus 2019 (2019-nCoV).Se o resultado do reteste for negativo, pode-se considerar que a amostra é negativa para o novo coronavírus 2019 (2019-nCoV).
Valor de julgamento positivo
O método da curva ROC é usado para determinar o valor CT de referência do kit e o valor de referência do controle interno é 40.
Interpretação dos resultados do teste
1.Cada experimento deve ser testado para controles negativos e positivos.Os resultados do teste só podem ser determinados quando os controles atendem aos requisitos de controle de qualidade
2. Quando os canais de detecção FAM e HEX são positivos, o resultado do canal CY5 (canal de controle interno) pode ser negativo devido à competição do sistema.
3. Quando o resultado do controle interno for negativo, se os canais de detecção FAM e HEX do tubo de ensaio também forem negativos, significa que o sistema está desativado ou a operação está errada, t o teste é inválido.Portanto, as amostras precisam ser testadas novamente.
